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【问】片段连了半年了,死活连不上,要看再不行就要延期了,求大神帮忙分析一下

2017-09-19 09:05http://e.gzyd88.com真题网 QQ363322014 微信号:qqnba2真题下载
作者: 感觉要延期哎 删除举报此信息
会员交流
感觉要延期哎

1楼:
2017-09-16 23:18:49
首先我一共要连接三个片段,直接连接表达载体,这三个片段都属于同一个基因家族,就是同源性不高,片段是pcr得到的(提取的研究材料全RNA反转录得到的cDNA),采用双酶切的方法,选取的是sal1和BamH1两个酶切位点, ... 质粒酶切图

感觉要延期哎

1楼:
2017-09-16 23:18:49
首先我一共要连接三个片段,直接连接表达载体,这三个片段都属于同一个基因家族,就是同源性不高,片段是pcr得到的(提取的研究材料全RNA反转录得到的cDNA),采用双酶切的方法,选取的是sal1和BamH1两个酶切位点, ... 最不能理解的是我的目的片段也被切碎了,这是为什么呢,直接过柱回收根本没东西,第三,四道是回收片段图

感觉要延期哎

求帮忙分析一下:cry::cry::cry::cry:

不吃M的鱼

既然总是会切碎,就不要用酶切的方法喽。换换overlap的方法,推荐用一下天根的EasyGeno,便宜好用,我们现在都用这个。NEB的也用过,太贵了。

HZAUAS

你要连的三个片段分别是多大,是目的片段和载体的比例、浓度不对吗?另外你目的片段里有没有潜在的酶切位点啊

感觉要延期哎

6楼:
2017-09-17 17:23:27
你要连的三个片段分别是多大,是目的片段和载体的比例、浓度不对吗?另外你目的片段里有没有潜在的酶切位点啊 三个片段分别是960.1200.1500,前两个连上了,酶切位点在选的时候都是分析过,片段里是没有的,载体里也是唯一的

感觉要延期哎

6楼:
2017-09-17 17:23:27
你要连的三个片段分别是多大,是目的片段和载体的比例、浓度不对吗?另外你目的片段里有没有潜在的酶切位点啊 我查过说是载体大切效果不好,会是这个原因么

感觉要延期哎

5楼:
2017-09-17 09:46:47
既然总是会切碎,就不要用酶切的方法喽。换换overlap的方法,推荐用一下天根的EasyGeno,便宜好用,我们现在都用这个。NEB的也用过,太贵了。 ……换方法是不可能了,老板不给买_(:_」∠)_

不吃M的鱼

你连3个片段怎么只用了2个片段?是一个一个连上去的吗?我们通常是4个酶切位点,切好了一块连的。

不吃M的鱼

10楼:
2017-09-17 18:39:44
你连3个片段怎么只用了2个片段?是一个一个连上去的吗?我们通常是4个酶切位点,切好了一块连的。 看错了,你是要把3个片段分别连到同一个载体上,那你载体直接用前面酶切的不是很好吗?你是之前连的空载太多了吗?

感觉要延期哎

11楼:
2017-09-17 18:42:22
看错了,你是要把3个片段分别连到同一个载体上,那你载体直接用前面酶切的不是很好吗?你是之前连的空载太多了吗?
... 不不不,是分别连,不好意思我没说清楚,我是要构建三个重组载体

不吃M的鱼

3楼:
2017-09-16 23:21:54
最不能理解的是我的目的片段也被切碎了,这是为什么呢,直接过柱回收根本没东西,第三,四道是回收片段图
... 第三第四道是你PCR产物的图?我建议你测个序看看有没有突变,还有就是酶切的片段量是不是太少了,通常要都切上的。不然量不够

感觉要延期哎

10楼:
2017-09-17 18:39:44
你连3个片段怎么只用了2个片段?是一个一个连上去的吗?我们通常是4个酶切位点,切好了一块连的。 我是三个片段分别连到载体上,构建三个重组载体……我这个描述的时候表达可能有问题

感觉要延期哎

13楼:
2017-09-17 19:54:06
第三第四道是你PCR产物的图?我建议你测个序看看有没有突变,还有就是酶切的片段量是不是太少了,通常要都切上的。不然量不够
... 我酶切的这个重组载体是测过序的,我也分析了测序结果,还是不存在我选择的这两个酶切位点的,但是因为测序两端的准确性不高,所以我也不好判断它是不是突变了,不过刚连上的时候我做酶切鉴定,一个小时酶切,是没有问题的,这是当时的酶切鉴定图

黑胡椒牛排

连进去的两个有没有去测序验证过

ken19860823

你先别纠结你那个中间载体了,你酶切原始载体先连第三个片段。如果没问题再连另外两个片段。先试试,有些片段克隆有方向性的。如果是这个问题,换个载体重新克隆或者换个感受态试试。半年早该各种都试过了,现在来这里不知道有用没啊。

感觉要延期哎

:shuai:我是三个片段要单独连接载体,构建三个重组载体,我初始的描述可能不太对……

感觉要延期哎

16楼:
2017-09-17 22:02:43
连进去的两个有没有去测序验证过 我是分别用三个片段构建三个重组载体,连上的两个已经送测序了

感觉要延期哎

17楼:
2017-09-17 22:37:00
你先别纠结你那个中间载体了,你酶切原始载体先连第三个片段。如果没问题再连另外两个片段。先试试,有些片段克隆有方向性的。如果是这个问题,换个载体重新克隆或者换个感受态试试。半年早该各种都试过了,现在来这 ... 我表述有误,我是要用三个片段构建三个重组载体,不是都连进一个载体里边

HZAUAS

8楼:
2017-09-17 18:13:36
我查过说是载体大切效果不好,会是这个原因么
... 按道理酶切位点单一的话,特异性应该很好。你用的那个公司的酶,换个牌子试试,或者换个快切的酶,另外酶切时间不要太长,酶切完记得终止反应,防止乱切。

感觉要延期哎

21楼:
2017-09-17 23:37:34
按道理酶切位点单一的话,特异性应该很好。你用的那个公司的酶,换个牌子试试,或者换个快切的酶,另外酶切时间不要太长,酶切完记得终止反应,防止乱切。
... 好的,我尝试做一个酶量和酶切时间的梯度试试看

黑胡椒牛排

都测序过了,应该是没问题的啊……酶切时间是有点长,一般半个小时就够了…… 搞不定就找公司做啊……PCR克隆也就几百块,何必纠结大半年

ken19860823

20楼:
2017-09-17 22:56:52
我表述有误,我是要用三个片段构建三个重组载体,不是都连进一个载体里边
... 那就先ta克隆下看看,看能不能克隆。如果双向都有,就酶切下来连到你的目的载体。

感觉要延期哎

24楼:
2017-09-18 08:24:15
那就先ta克隆下看看,看能不能克隆。如果双向都有,就酶切下来连到你的目的载体。
... 实验室就我用的这一个表达载体,没有t载体……比较穷困

ken19860823

25楼:
2017-09-18 08:25:17
实验室就我用的这一个表达载体,没有t载体……比较穷困
... 有的片段表(v在V型他嘎鱼v额v啊vv有vvv找他拆塔下雨擦擦真嘎擦擦出发vv啊GV要 TV去啊vv刚才雨真嘎GGAV让送vv的v在达会对不好用细菌有毒性的,换穿梭载体或者感受态是克隆实验你背的。

ken19860823

26楼:
2017-09-18 08:30:17
有的片段表(v在V型他嘎鱼v额v啊vv有vvv找他拆塔下雨擦擦真嘎擦擦出发vv啊GV要 TV去啊vv刚才雨真嘎GGAV让送vv的v在达会对不好用细菌有毒性的,换穿梭载体或者感受态是克隆实验你背的。
... 如果目的片段不能在该菌株扩增,这实验怎么设计都没用。另外你已经构建好的载体不能酶切获得模板这个问题,送测序,质粒没问题就换酶。(刚才下公交车手机放兜里乱发了一条,请删除)


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